PERHITUNGAN BAKTERI PADA MEDIA NA (Nutrien Agar)

A. ACARA
Praktikum perhitungan bakteri dengan media NA (Nutrien Agar).

B. PRINSIP
Metode ALT (Angka Lempeng Total) yang menyatakan bahwa satu sel bakteri akan menghasilkan satu koloni dan berdasarkan pada dugaan bahwa jumlah koloni yang tumbuh pada agar dalam cawan sesuai dengan jumlah bakteri semula.

C. TUJUAN
Mengetahui jumlah bakteri yang terkandung dalam sample dengan metode perhitungan ALT.

D. DASAR TEORI
Bakteri berasal dari bahasa latin bacterium (jamak : bacteria), adalah kelompok raksasa dari organisme hidup, berukuran sangat kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniseluler (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relative sederhana tanpa nucleus atau inti sel, cytoskeleton, dan organel lain seperti mitokondria dan kloroplas.
Bakteri adalah yang paling berlimpah dari semua organisme. Mereka tersebar (berada dimana-mana) di tanah, air, dan sebagai simbiosis dari organisme lain. Banyak pathogen merupakan bakteri, kebanyakan dari mereka kecil, biasanya hanya berukuran 0,5-5 mm, meski ada jenis dapat menjangkau 0,3 mm dalam diameter (Thiomargarita).
Mereka umumnya memiliki dinding sel, seperti sel hewan dan jamur, tetapi dengan komposisi yang berbeda (peptidogligan). Banyak yang bergerak menggunakan flagella, yang berbeda dalam strukturnya dari flagella kelompok lain.

Berbagai bentuk tubuh bakteri
1. kokus (coccus)
Adalah bakteri yang berbentuk bulat seperti bola, dan mempunyai beberapa variasi sebagai berikut :
o Mikrococcus, jika kecil dan tunggal.
o Diplococcus, jika berganda dua-dua
o Tetracoccus, jika bergandengan empat dan membentuk bujusangkar.
o Sarcina, jika bergerombol membentuk kubus
o Staphylococcus, jika bergerombol
o Streptococcus, jika bergandengan membentuk rantai
2. Basil (Bacillus)
Adalah kelompok bakteri yang berbentuk batang atau silinder, dan mempunyai variasi sebagai berikut :
o Diplobacillus, jika bergandengan dua-dua
o Streptobacillus, jika bergandengan membentuk rantai
3. spiril (spirilum)
Adalah bakteri yang berbentuk langkung dan mempunyai variasi sebagai berikut :
o Vibrio (berbentuk koma), jika lengkung kurang dari setengah lingkaran
o Spiral, jika lengkung lebih dari setengah lingkaran
Kondisi lingkungan yang mendukung dapat memacu pertumbuhan dan reproduksi bakteri. Factor-faktor lingkungan yang dapat berpengaruh terhadap pertumbuhan dan reproduksi bakteri adalah :
o Suhu
o Kelembaban
o Cahaya
Berikut beberapa jenis bakteri yang menguntungkan dalam proses pembuatan beberapa produk pangan :

NO Nama Produk atau Makanan Bahan Baku Bakteri yang Berperan
1 Yoghurt Susu Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus
2 Mentega Susu Streptococcus lactis
3 Terasi Ikan Lactobacillus sp.
4 Asinan buah-buahan Buah-buahan Lactobacillus sp.
5 Sosis Daging Pediococcus cerevisiae
6 Kefin Susu Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus lactis


E. ALAT DAN BAHAN
• Alat
o Cawan petri steril
o Erlenmeyer
o Hot plate
o Lampu spirtus atau Bunsen
o Autoclave
o Incubator
o Micropipette dan tip (tip steril)
o Botol
• Bahan
o Media NA (Nutrien Agar)
o Aquadest
o Sample air
o Sample baso

F. PROSEDUR
 PERSIAPAN ALAT
o Menyiapkan cawan Petri, tip, botol sample bertutup, tabung reaksi bertutup.
o Membersihkan cawan Petri yang akan dipergunakan dan membungkusnya dengan kertas koran atau perkamen
o Memipet larutan garam fisiologis (LGF) sebanyak 9 mL dan masukan dalam tabung reaksi, menutupnya dengan tutup tabung reaksi atau sumbat dengan kapas.
o Memipet aquadest sebanyak 9 mL dan masukan dalam tabung reaksi, menutupnya dengan tutup tabung reaksi atau sumbat dengan kapas.
o Memipet aquadest sebanyak 225 mL dan masukan dalam botol bertutup.
o Memasukan tip yang merupakan pasangan micropipette ke dalam botol yang dialasi tisu dan diberi tutup.
o Mensterilisasi alat-alat diatas menggunakan autoclave dengan suhu 121oC

 PERSIAPAN LARUTAN PENGENCER
o Untuk membuat LGF 0,85% diperlukan NaCl tekhnis sebanyak 0,85 g dan dilarutkan dalam 100 mL aquadest.

 PERSIAPAN MEDIA NA (Nutrient Agar)
o Menimbang media NA sebanyak 23 gram
o Melarutkan media dalam aquadest sebanyak 1 liter
o Mengaduk sampai larut dan panaskan sampai tidak larutan bening
o Menutup dengan kapas dan sterilkan dengan autoclave 121oC selama 15 menit

 PERSIAPAN SAMPLE
o Untuk sample air, pipet sebanyak 25 mL dan masukan dalam botol yang berisi aquadest steril sebanyak 225 mL, kocok selama 25 kali.
o Untuk sample baso, dihancurkan terlebih dahulu dengan menggunakan blender dan timbang sebanyak 25 mL dan masukan dalam botol yang berisi aquadest steril. Kocok selama 25 kali.
o Melakukan semua perlakuan diatas secara aseptis

 INOKULASI
o Memipet larutan sample sebanyak 1 mL, dan memasukannya dalam tabung reaksi yang berisi larutan steril beri label 10-2
o Kemudian mengocok tabung tersebut dengan menggunakan vortex selama beberapa detik.
o Setelah dikocok pipet larutan dalam tabung tersebut sebanyak 1 mL dan masukan dalam tabung reaksi berisi larutan steril yang lain dan beri label 10-3
o Pipet kembali larutan dalam tabung 10-2 dan masukan dalam cawan Petri steril beri label 10-2 pada cawan
o Melakukan hal yang sama sampai tabung reaksi ke 10-7.
o Menuangkan media hangat ke dalam setiap cawan Petri yang sudah berisi larutan sample.
o Menggoyangkan Petri dengan cara memutarnya sehingga diperkirakan sample dan media dapat bercampur.
o Biarkan sampai media membeku
o Melakukan semua perlakuan diatas secara aseptis

 INKUBASI
o Setelah media membeku, masukan dalam incubator dengan posisi terbalik (bagian tutup berada di bawah).
o Suhu selama inkubasi adalah 40oC selama ± 48 jam.

G. DATA PENGAMATAN
• SAMPLE AIR I METODE ALT
PENGENCERAN JUMLAH MIKROBA
KEL 1 KEL 2 KEL 3 KEL 4
10-3 17 3 1 2
10-4 11 - - -
10-5 4 - 3 (terkontaminasi jamur) 1
10-6 2 - - -

Kelompok 1 : 17 x 10-3 = 1,7 x 104
11 x 10-4 = 11 x 104
4 x 10-5 = 40 x 104
2 x 10-6 = 200 x 104
Sehingga dapat diketahui jumlah bakteri perkiraan adalah 1,7 x 104 koloni bakteri/mL

Kelompok 2 : 3 x 10-3 = 3 x 103
Sehingga dapat diketahui jumlah bakteri perkiraan adalah 3 x 103 koloni bakteri/mL.


Kelompok 3 : 1 x 10-3 = 1 x 103
3 x 10-4 = 30 x 103
Sehingga dapat diketahui jumlah bakteri perkiraan adalah 30 x 103 koloni bakteri/mL.

Kelompok 4 : 2 x 10-3 = 2 x 103
1 x 10-5 = 100 x 105
Sehingga daapt diketahui jumlah bakteri perkiraan adalah 2 x 103 koloni bakteri/mL.

• SAMPLE AIR II
PENGENCERAN JUMLAH MIKROBA
KEL 1 KEL 2
10-3 3 2
10-4 1 1
10-5 - 2
10-6 2 7
10-7 - 2
10-8 2 5

Kelompok 1 : 3 x 10-3 = 0,3 x 104
1 x 10-4 = 1 x 104
2 x 10-6 = 200 x 104
2 x 10-8 = 20000 x 104
Sehingga dapat diketahui jumlah bakteri perkiraan adalah 1 x 104 koloni bakteri/mL
Kelompok 2 : 2 x 10-3 = 0,2 x 104
1 x 10-4 = 1 x 104
2 x 10-5 = 20 x 104
7 x 10-6 = 700 x 104
2 x 10-7 = 2000 x 104
5 x 10-8 = 20000 x 104
Sehingga dapat diketahui Jumlah bakteri perkiraan adalah 1 x 104 koloni bakteri/mL
• SAMPLE BASO
PENGENCERAN JUMLAH MIKROBA
KEL 3 KEL 4
10-3 507 400
10-4 290 12
10-5 38 55
10-6 6 7
10-7 6 6
10-8 4 4

Kelompok 3 : 507 x 10-3 = 5,07 x 105
290 x 10-4 = 29,0 x 105
38 x 10-5 = 38 x 105
6 x 10-6 = 60 x 105
6 x 10-7 = 600 x 105
4 x 10-8 = 4000 x 105
Sehingga dapat diketahui jumlah bakteri adalah 38 x 105 koloni bakteri/mL

Kelompok 4 : 400 x 10-3 = 4,00 x 105
12 x 10-4 = 1,2 x 105
55 x 10-5 = 55 x 105
7 x 10-6 = 70 x 105
6 x 10-7 = 600 x 105
4 x 10-8 = 4000 x 105
Sehingga daapt diketahui jumlah bakteri adalah 55 x 105 koloni bakteri/mL

H. PEMBAHASAN
Praktikum pengujian mikrobiologi ini dibedakan berdasarkan sample yang dianalisa. Terdapat 2 sample yang dianalisa, yaitu air dan baso. Pada raktikum yang pertama, semua kelompok menganalisa jumlah mikroba yang terdapat dalam air. Dan untuk analisa yang kedua kelompok 1 dan 2 menganalisa mikroba dalam air sedangkan baso dianalisa olah kelompok 3 dan 4.
Sebelum praktikum dilakukan, perlakuan sterilisasi tidak hanya dilakukan pada alat dan media, meja kerja serta tangan praktikan disemprot dengan alcohol 70% unutk menghindarai kontaminasi mikroba yang tidak diinginkan.

• SAMPLE AIR
Sample air yang dipergunakan saat praktikum diambil dari air yang kran yang ada di laboratorium, dengan melakukan pengujian mikroba maka dapat diketahui berapa jumlah atau kandungan mikroba dalam sample.
Setelah sample disiapkan, maka langkah selanjutnya adalah memasukan sample ke dalam botol yang berisi aquadest steril 225 mL, hal ini dilakukan secara aseptis (steril). Untuk mendapatkan suasana steril maka setiap langkah kerja dilakukan di dekat api Bunsen atau spirtus. Kemudian botol dikocok secara manual dengan tangan sebanyak 25 kali.
Setelah sample sudah dilarutkan dalam aquadest steril, maka langkah selanjutnya adalah memipet larutan sample dalam botol sebanyak 1 mL dan masukan dalam tabung reaksi yang berisi aquadest steril sebanyak 9 mL, kemudian kocok dengan menggunakan vortex, pengocokan dengan menggunakan vortex ini bertujuan untuk mengencerkan larutan sample dengan aquadest steril dalam tabung, sehingga tabung reaksi tersebut diberi label pengenceran 10-2.
Pengenceran dari 10-2 tersebut diambil lagi sebanyak 2 mL. 1 mL dimasukan dalam tabung reaksi yang lain (yang kemudian diberi label 10-3), dan 1 mL yang lain dimasukan dalam cawan Petri steril.
Kemudian media NA (Nutrien Agar) dituangkan pada cawan petri yang berisi sample dari pengenceran 10-2, setelah itu kocok petri dengan cara menggoyangkannya sehingga diperkirakan sample dan media telah bercampur. Pengenceran serta penambahan media terus dilakukan sampai pengenceran 10-6, prosedur serta cara pengenceran dilakukan seperti diatas.
Setelah media mengeras, kemudian diinkubasikan dalam incubator dengan suhu ±45oC selama 2 hari (48 jam). Cawan petri yang berisi campuran media NA dan sample dalam incubator diletakan secara terbalik, posisi terbalik ini dimaksudkan untuk menghindari tercampurnya uap yang dihasilkan dengan media. Karena apabila cawan Petri diletakan secara terbalik maka uap yang dihasilkan dari media akan tertampung pada tutupnya dan menetes ke bawah (media).
Perlakuan blanko juga dilakukan pada pengujian mikrobiologi ini, blanko adalah perlakuan yang sama dengan proses serta prosedur yang sama, hanya saja tanpa sample. media blanko juga diinkubasikan selama 2 hari. Berdasarkan teori, blanko seharusnya tidak tercemar oleh mikroba jika dilakukan dengan baik secara aseptis dan berdasarkan hasil pengamatan maka dapat diketahui pada hasil blanko kelompok 3 tercemar oleh mikroba sebanyak 1 koloni. Terjadinya cemaran ini dapat disebabkan karena selama praktikum meja kerja serta tangan praktikan tidak disterilkan terlebih dahulu dengan alcohol 70% atau karena saat menuangkan media tidak dilakukan secara aseptis.
Selain blanko yang terkontaminasi, cawan petri ysng berisi sample pun terkontaminasi oleh jamur, hal ini dialami oleh kelompok 3 pada cawan yang berisi sample dari pengenceran 10-4. Kontaminasi ini dapat disebabkan saat menuangkan media atau memasukan sample perlakuan aseptis tidak dilakukan secara maksimal.
Pengamatan dan perhitungan dilakukan setelah 2 hari dinkubasikan, koloni-koloni bakteri akan terlihat pada dasar cawan Petri tersebut, koloni bakteri berbentuk bulatan-bulatan kecil yang ukurannya bervariasi.
Berdasarkan pengamatan dan perhitungan maka dapat diketahui bahwa untuk kelompok 1 jumlah bakteri perkiraannya adalah 1,7 x 104 koloni bakteri/mL, kelompok 2 jumlah bakteri perkiraannya adalah 3 x 103 kononi bakteri/mL, kelompok 3 jumlah bakteri perkiraannya adalah 30 x 103 koloni bakteri/mL, dan kelompok 4 adalah 2 x 103 koloni bakteri/mL.
Karena setiap cawan tidak ada yang berjumlah antara 25-250 koloni bakteri, maka perhitungan diatas berdasarkan pada peraturan perhitungan “Jika rata-rata jumlah koloni masing-masing cawan tidak terletak antara 25 dan 250 koloni, hitung jumlah koloni dari masing-masing koloni san nyatakan sebagai jumlah bbakteri perkiraan per milliliter atau gram.”

• SAMPLE AIR II
Pada praktikum yang kedua, sample yang dipergunakan masih air yang diambil dari sumber yang sama, yaitu dari kran di laboratorium pengujian. Pengujian dengan sample ini tidak dilakukan oleh semua kelompok, pengujian untuk sample air dilakukan oleh kelompok 1 dan 2, selain itu yang berbeda adalah jumlah pengenceran yang dilakukan, yaitu dari pengenceran 10-3 sampai pada 10-8.
Untuk pengencer yang dipergunakan saat pengujian yang kedua ini tidak lagi aqudest steril tetapi larutan garam fisiologis 0,85% (LGF) yang steril. Jumlah LGF sebagai pengencer masih sama yaitu 9 mL untuk masing-masing tabung reaksi. Pengencer dalam botol untuk sample juga masih berjumlah sama yaitu 225 mL LGF steril.
Semua pengujian dilakukan seperti saat praktikum yang pertama. Baik langkah kerja, persiapan alat, pesiapan media, persiapan sample, dll. Hanya saja karena pengencer yang diipergunakan adalah LGF 0,85% maka terlebih dahulu membuat LGF 0,85% tersebut.
LGF 0,85% adalah larutan garam tekhnis yang dipergunakan untuk membantu mengembangbiakan bakteri, apabila konsentrasi LGF lebih tinggi dari ini maka bakteri tidak dapat tumbuh, karena garam memiliki sifa antibakteri.
Media yang dipergunakan masih sama yaitu media NA (Nutrient Agar), hal ini dikarenakan yang akan dikembangkan adalah bakteri, dan media NA adalah media yang diipergunakan untuk mengembangkan bakteri.
Perlakuan blanko juga dilakukan untuk pengujian yang kedua ini, masing-masing kelompok mengerjakan 1 cawan yang hanya berisi media saja. Setelah diinkubasikan selama 2 hari dalam incubator maka dapat diketahui bahwa cawan blanko terkontaminasi.
Kontaminasi pada blanko terjadi pada kedua kelompok. Untuk kelompok 1, blanko terkontaminasi oleh 11 koloni mikroba. Sedangkan untuk kelompok 2 blanko terkontaminasi oleh 15 koloni mikroba. Hal ini dapat terjadi karena perlakuan aseptis tidak dilakukan dengan baik oleh masing-masing kelompok.
Berdasarkan hasil pengamatan dan perhitungan, maka dapat diketahui bahwa pada kelompok 1 jumlah bakteri perkiraannya adalah 1 x 104, dan untuk kelompok 2 adalah 1 x 104. Hasil yang sama ini menunjukan bahwa presisi dan akurasi pengujian sangat tinggi

• SAMPLE BASO
Masih ada praktikum yang kedua, sample yang dipergunakan adalah baso dlama kemasan yang banyak beredar di pasaran, sample baso yang dipakai pada saat praktikum akan mencapai masa kadaluarsa. Sample ini dipergunakan oleh kelompok 3 dan 4, jumlah pengenceran yang dilakukan sama dengan kelompok lain yang mengerjakan sample air, yaitu dari pengenceran 10-3 sampai pada 10-8.
Untuk pengencer yang dipergunakan saat pengujian yang kedua ini pun sama dengan pengujian sample air yang kedua yaitu dengan larutan garam fisiologis 0,85% (LGF) yang steril. Jumlah LGF sebagai pengencer masih sama yaitu 9 mL untuk masing-masing tabung reaksi. Pengencer dalam botol untuk sample juga masih berjumlah sama yaitu 225 mL LGF steril.
Karena sample yang dipergunakan adalah baso yang bersifat padat, maka sebelum dipergunakan harus dihaluskan terlebih dahulu. Proses penghalusan dilakukan dengan menggunakan blender. Setelah dihaluskan baru kemudian sample ditimbang sebanyah 25 gram. Dan kemudian dimasukan dalam botol berisi LGF steril 225 mL.
Media yang dipergunakan masih sama yaitu media NA (Nutrient Agar), hal ini dikarenakan yang akan dikembangkan adalah bakteri, dan media NA adalah media yang diipergunakan untuk mengembangkan bakteri.
Perlakuan blanko juga dilakukan untuk pengujian dengan sample baso, perlakuan balnko untuk kelompok 3 dilakukan sebanyak 2 cawan (duplo) dan kelompok 4 sebanyak 1 cawan. Setelah diinkubasikan selama 2 hari dalam incubator maka dapat diketahui bahwa cawan blanko terkontaminasi seperti halnya pada kelompok 1 dan 2 .
Kontaminasi pada blanko terjadi pada kedua kelompok. Untuk kelompok 3 blanko pertama terkontaminasi oleh 53 koloni mikroba dan yang yang kedua terkontaminasi oleh 84 koloni mikroba. Sedangkan untuk kelompok 4 blanko terkontaminasi oleh 3 koloni mikroba. Hal ini dapat terjadi karena perlakuan aseptis tidak dilakukan dengan baik oleh masing-masing kelompok.
karena terdapat koloni yang berjumlah antara 25-250 koloni maka dapat diketahui bahwa jumlah bakteri untuk sample baso pada kelompok 3 jumlah bakteri adalah 38 x 105, dan untuk kelompok 4 adalah 55 x 105.






I. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil praktikum, pengamatan dan perhitungan, maka dapat diketahui bahwa jumlah bakteri dengan menggunakan metode Angka Lempeng Total (ALT) pada sampel air yang pertama tidak didapatkan hasil koloni bakteri yang sesuai dengan angka pengenceran. Karena jumlah koloni yang ada tidak termasuk dalam rentan 25-250 koloni bakteri sehingga hasilnya dinyatakan dalam jumlah bakteri perkiraan.
Sedangkan untuk sampel baso didapat rata-rata jumlah bakteri sebanyak 4,6 x 106 bakteri/mL. hal ini mengindikasikan bahwa sample bakso yang dipergunakan sudah tercemar dan mutu produknya sudah turun.

J. DAFTAR PUSTAKA
• Dwidjoseputro. 2005. DASAR-DASAR MIKROBIOLOGI. Jakarta : Penerbit Djambatan.
• Supardi, Imam. 1999. MIKROBIOLOGI DALAM PENGOLAHAN DAN KEAMANAN PANGAN. Bandung : Yayasan Adikarya Ikapi
• Jennie, Betty Sri Laksmi. 1978. MIKROBIOLOGI HASIL PERTANIAN. Jakarta : Departemen Pendidikan dan Kebudayaan
• Muctadi, Deddy. 1980. PETUNJUK PRAKTIK MIKROBIOLOGI. Jakarta: Departemen Pendidikan dan Kebudayaan.